軟瓊脂實(shí)驗(yàn)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

軟瓊脂實(shí)驗(yàn)是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中不常見實(shí)驗(yàn)之一，通常由從事細(xì)胞實(shí)驗(yàn)多年的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行操作，通過的實(shí)驗(yàn)操作，以實(shí)驗(yàn)結(jié)果的性。

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更新時(shí)間：2026-03-20

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步：配制瓊脂

用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如DMEM）配制1%-1.2%的高熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，加熱煮沸使其全融化，隨后置于42-45°C水浴中恒溫冷卻，防止凝固。
將等體積的2×全培養(yǎng)基（含2×濃度的血清和雙抗）預(yù)熱至相同溫度。
將兩者等體積混合，得到終濃度為0.5%-0.6%的底層瓊脂工作液。

第二步：輔制底層膠

第三步：制備細(xì)胞懸液與輔制上層膠

制備細(xì)胞懸液：用全培養(yǎng)基重懸待測(cè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)。細(xì)胞濃度是關(guān)鍵，通常每孔接種1000-10000個(gè)細(xì)胞，具體取決于細(xì)胞成克隆能力。
混合：將預(yù)熱的上層瓊脂工作液與含有細(xì)胞的培養(yǎng)基等體積混合，確保細(xì)胞均勻分布，形成終濃度為0.15%-0.2%的含細(xì)胞上層瓊脂混合液。
輔上層膠：立即將1-1.5 mL混合液輕柔地加在已凝固的底層膠上，注意不要破壞底層膠。輕輕晃動(dòng)鋪平。
凝固：室溫下靜置10-15分鐘，使其全凝固。

第四步：培養(yǎng)與觀察

添加培養(yǎng)基：待上層膠凝固后，沿孔壁緩慢加入1-2 mL預(yù)熱的新鮮全培養(yǎng)基，覆蓋膠的表面，以防止瓊脂干燥，并為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)。注意不要沖散上層膠。
培養(yǎng)：將培養(yǎng)板置于37°C， 5% CO? 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
換液：每隔2-3天，小心吸去舊培養(yǎng)基，沿孔壁緩慢加入新鮮培養(yǎng)基。此步驟需格外小心，避免破壞軟膠。
觀察：培養(yǎng)1-3周后，在倒置顯微鏡下觀察克隆形成情況。惡性程度高、增殖快的細(xì)胞通常1-2周即可見明顯克隆。

第五步：染色、計(jì)數(shù)與分析

手動(dòng)計(jì)數(shù)：在顯微鏡下，計(jì)數(shù)直徑大于50-100 μm（或細(xì)胞數(shù)>50個(gè)）的克隆。通常使用低倍鏡（4×或10×物鏡）掃描整個(gè)孔。
軟件分析：可使用ImageJ等圖像分析軟件，對(duì)整孔圖像進(jìn)行自動(dòng)克隆識(shí)別和計(jì)數(shù)。
報(bào)告結(jié)果：通常以克隆形成率表示：(克隆數(shù) / 接種細(xì)胞數(shù)) × 100%。或直接比較不同處理組之間的克隆數(shù)量和大小。