一、實驗原理

1. 細胞在不同周期（G0/G1、S、G2/M）的 DNA 總量不同

• G0/G1：二倍體，DNA 含量為 2N

• S 期：DNA 復(fù)制，含量介于 2N～4N

• G2/M 期：DNA 已復(fù)制完成，含量為 4N

2. 使用 DNA 熒光染料（PI、DAPI、7-AAD 等）對 DNA 定量染色

3. 流式細胞儀檢測熒光強度 → 擬合出各周期細胞比例

• 嵌入 DNA 雙鏈，熒光強度與 DNA 含量成正比

• 需用 RNase A 去除 RNA，避免干擾

二、所需試劑

• 70% 乙醇（固定）

• PBS

• RNase A（去除 RNA）

• PI 染色液

• 含血清培養(yǎng)基、胰酶

三、標準實驗步驟（貼壁細胞通用）

1. 細胞處理與收集

1. 細胞給藥 / 處理后，棄培養(yǎng)基

2. 胰酶消化，含血清培養(yǎng)基終止消化

3. 轉(zhuǎn)入離心管，1000 rpm 離心 5 min，棄上清

4. PBS 重懸洗滌一次，再次離心棄上清

關(guān)鍵：必須單細胞懸液，不能有團塊，否則周期圖畸形。

2. 固定（4℃過夜標準）

1. 用 預(yù)冷 PBS 輕輕重懸細胞

2. 緩慢逐滴加入 -20℃預(yù)冷 70% 乙醇，邊加邊混勻

3. 4℃固定 ≥4 h 或過夜

3. 洗滌去乙醇

1. 離心棄乙醇固定液

2. PBS 洗 1～2 次，離心棄上清

4. RNase 消化（必須?。?/h2>

1. 加入 RNase A 工作液

2. 37℃水浴 30 min

   作用：降解 RNA，避免 PI 與 RNA 結(jié)合造成假高熒光

5. PI 染色

1. 加入 PI 染液（終濃度 50 μg/mL 左右）

2. 避光 室溫染色 15–30 min

3. 300 目濾網(wǎng)過濾后上機檢測

四、上機與分析

1. 激發(fā)：488 nm 激光

2. 接收：FL2 通道（PI 紅色熒光）

3. 用 ModFit / FlowJo 進行周期擬合

   輸出指標：

• G0/G1 期比例

• S 期比例（DNA 合成活躍）

• G2/M 期比例

• Sub-G1 期（凋亡細胞，DNA 碎片 <2N）

五、結(jié)果解釋

• G0/G1 升高：細胞阻滯在 G1 期，增殖減慢

• S 期降低：DNA 合成受抑制

• G2/M 升高：細胞阻滯在分裂期

• Sub-G1 峰明顯：凋亡細胞增多