細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：
人體內(nèi)的細(xì)胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡則是病理性的，到目前為此，人們已經(jīng)知道細(xì)胞的死亡起碼有兩種方式，即細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡（apoptosis）。 細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著的作用。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程。這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。凋亡過(guò)程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系。如腫瘤、自身免疫性疾病等，能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡的因素很多，如射線、藥物等。

細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別：
壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無(wú)序變化的死亡過(guò)程。表現(xiàn)為細(xì)胞 脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。
凋亡是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的生理性病理性刺激信號(hào)，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過(guò)程。其細(xì)胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。

形態(tài)學(xué)變化：
形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)的變化是多階段的，往往涉及單個(gè)細(xì)胞，即便是一小部分細(xì)胞也是非同步發(fā)生的。先出現(xiàn)的是細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，然后是細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180bp-200bp片段；胞膜有小泡狀形成，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜結(jié)構(gòu)仍然完整，終可將凋亡細(xì)胞遺骸分割包裹為幾個(gè)凋亡小體，無(wú)內(nèi)容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應(yīng)，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。
a，形態(tài)學(xué)
原理：一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。 常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三種染料與　DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、方便，成本低
缺點(diǎn)：很主觀，非常依賴實(shí)驗(yàn)者的經(jīng)驗(yàn)
b，DNA含量

原理：細(xì)胞凋亡時(shí),核酸內(nèi)切酶激活,導(dǎo)致DNA 斷裂,這是凋亡的特征性表現(xiàn),也為FCM 鑒別凋亡細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞用乙醇、TrtionX—100 處理后細(xì)胞膜上出現(xiàn)漏洞，小片段DNA 從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái),使其DNA 含量低于正常細(xì)胞的二倍體。用碘化丙啶( PI) 染色后分析,可在二倍體G1峰前出現(xiàn)“亞二倍體"峰，即細(xì)胞凋亡峰(APO峰) ,根據(jù)APO峰可測(cè)出凋亡細(xì)胞百分率。
優(yōu)點(diǎn)：該法簡(jiǎn)單易行,可大批定量檢測(cè)凋亡標(biāo)本,亦可同時(shí)分析細(xì)胞的細(xì)胞周期位置。
缺點(diǎn)：DNA 含量測(cè)定在檢測(cè)細(xì)胞凋亡中的局限性在于其特異性和敏感性均不高。特異性不高是因?yàn)锳PO 峰代表了一組細(xì)胞群體，包括凋亡細(xì)胞、機(jī)械損傷細(xì)胞、低DNA 含量的細(xì)胞或不同染色體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，在上述情況下,DNA 與熒光染料的結(jié)合量均小。另外，非固定的細(xì)胞在低滲溶液中被溶解時(shí)，可導(dǎo)致的核碎片出現(xiàn)，此時(shí)APO 峰的細(xì)胞數(shù)目只代表了核碎片的數(shù)目，并不代表凋亡細(xì)胞數(shù)目。敏感性較差的原因是細(xì)胞凋亡早期只有DNA 斷裂點(diǎn)出現(xiàn)，但尚未出現(xiàn)DNA 片段的丟失，所以該法不能檢出早期凋亡細(xì)胞和發(fā)生于S 期或G2/ M 期的凋亡細(xì)胞，因?yàn)槠鋵?shí)際含量不低于二倍體細(xì)胞所含的DNA，因此該法進(jìn)行凋亡細(xì)胞分析時(shí)應(yīng)結(jié)合其它形態(tài)或生化方法，以期更地分析細(xì)胞的凋亡狀態(tài)。
c，AnnexinV/PI

原理：PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久發(fā)生，可能作為免疫系統(tǒng)的識(shí)別標(biāo)志。AnnexinV，一個(gè)鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能專一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS，再通過(guò)簡(jiǎn)單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。由于這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測(cè)（懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測(cè)方法相結(jié)合來(lái)標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。
優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞凋亡時(shí)膜上PS 外露早于DNA 斷裂發(fā)生,因此該法檢測(cè)早期凋亡更為靈敏，且該法不需要固定細(xì)胞，避免了PI 法因固定造成的細(xì)胞碎片過(guò)多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA 片段丟失，因此更加省時(shí)，結(jié)果亦更可靠，是目前為理想的凋亡定量檢測(cè)方法。
缺點(diǎn)：檢測(cè)早期凋亡更好，好與其他檢測(cè)晚期凋亡的方法結(jié)合使用，對(duì)檢測(cè)試劑、儀器要求較高。
d，線粒體膜電位
原理：在受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個(gè)陽(yáng)離子性的染色劑，對(duì)此改變非常敏感，呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細(xì)胞中，它在線粒體中形成聚集體，發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。凋亡細(xì)胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細(xì)胞液中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號(hào)。

優(yōu)點(diǎn)：采用熒光的檢測(cè)方法，放大了凋亡信號(hào)，靈敏度高。
缺點(diǎn)：不能區(qū)分細(xì)胞凋亡或其他原因?qū)е碌木€粒體膜電位的變化。

e，TUNEL

原理：由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活,細(xì)胞自身的染色質(zhì)或DNA 被切割，并產(chǎn)生與DNA 斷點(diǎn)數(shù)目相同的3’ 羥基末端，TdT 可以將生物素化的dUTP 標(biāo)記至3’ 羥基末端，通過(guò)卵白素2FITC 系統(tǒng)，使DNA 的斷點(diǎn)部位發(fā)生特異熒光而簽別出凋亡細(xì)胞。但由于斷裂DNA 的標(biāo)記過(guò)程比較復(fù)雜，涉及多種因素，所以末端標(biāo)記的陰性結(jié)果并不代表DNA鏈的完整，應(yīng)排除方法上的問(wèn)題，如TdT 酶活力的喪失等諸多影響因素。因此應(yīng)用TdT 末端標(biāo)記法鑒別凋亡細(xì)胞同時(shí)設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照組，以便得到可靠結(jié)果。
優(yōu)點(diǎn)：TdT末端標(biāo)記法是鑒別凋亡細(xì)胞比較特異的一種方法
缺點(diǎn)：標(biāo)記過(guò)程比較復(fù)雜，涉及多種因素，實(shí)驗(yàn)成敗受試劑質(zhì)量、操作手法影響較大。

f，Caspase-3/7
原理：Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中主要的終末剪切酶，Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成。Caspase-3主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)，該酶與DNA修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)有關(guān)。在細(xì)胞凋亡啟動(dòng)時(shí)，116kD的PARP在Asp216-Gly217之間被caspase-3剪切成31kD和85kD兩個(gè)片段，使PARP中與DNA結(jié)合的兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)與羧基端的催化區(qū)域分離，不能發(fā)揮正常功能。結(jié)果使受PARP負(fù)調(diào)控影響的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，引起細(xì)胞凋亡?？梢酝ㄟ^(guò)Western blot，酶活性檢測(cè)，流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)檢測(cè)Caspase 3/7的活性與表達(dá)。
優(yōu)點(diǎn)：Caspase 3/7活性檢測(cè)，可檢測(cè)的方法學(xué)較廣，靈敏度較高。
缺點(diǎn)：需要和下游PARP的檢測(cè)，同時(shí)驗(yàn)證。

g，PARP

原理：PARP，即poly(ADP-ribose) polymerase，是定位在細(xì)胞核內(nèi)，和應(yīng)激條件下DNA修復(fù)密切相關(guān)的一種酶。PARP在體外可以被多種Caspase剪切，在體內(nèi)是Caspase 3的主要剪切對(duì)象。對(duì)于人PARP，在Asp124和Gly215之間被Caspase剪切后，使PARP羧基端的催化結(jié)構(gòu)域(89kD)和氨基端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(24kD)相分離，從而使PARP失去其酶活力。PARP對(duì)于細(xì)胞的穩(wěn)定和存活非常重要，PARP失去酶活力會(huì)加速細(xì)胞的不穩(wěn)定。PARP剪切被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)，也通常被認(rèn)為是Caspase 3激活的指標(biāo)。
優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)方法常規(guī)可信，凋亡特異性高
缺點(diǎn)：不能檢測(cè)凋亡早期

服務(wù)說(shuō)明：
1. 凋亡檢測(cè)方法可由客戶，也可由我們，后由客戶抉擇；
2. 凋亡實(shí)驗(yàn)涉及的細(xì)胞、藥物，可由客戶提供，也可查看公司的產(chǎn)品庫(kù)，亦可由我們代購(gòu)；
3. 凋亡實(shí)驗(yàn)建議選擇2種不同的方法相互驗(yàn)證。
提交的產(chǎn)品和資料：
實(shí)驗(yàn)報(bào)告

目前，上海申知心生物科技有限公司，主營(yíng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)、服務(wù)、動(dòng)物模型構(gòu)建、細(xì)胞株、elisa試劑盒等，歡迎廣大科研愛(ài)好者前來(lái)咨詢選購(gòu)！